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质粒类产品整体介绍-V1.0

质粒基本介绍

质粒（Plasmid），染色体外能进行自主复制的遗传单位（脱氧核糖核酸，DNA），是目前基因功能研究中常用的一种研究工具，根据其对基因表达的用途可分为过表达质粒、干扰质粒和敲除质粒；根据其病毒源性，又可分为病毒和非病毒质粒（如下图）。

基安生物拥有丰富的病毒质粒和非病毒质粒的设计及构建的经验，可以根据老师的实验目的，选择合适的质粒体系，完成老师目的基因过表达、干扰或敲除的实验需求。

质粒骨架

常规质粒骨架：

复制起点（Ori）：在质粒骨架中常以Ori结尾标记，复制方向为Ori箭头的方向。分为原核Ori和真核Ori，决定了质粒的宿主及质粒的拷贝数，具有相同Ori的质粒不可共转染（质粒的不相容性）。Ori处的A和T特别多，相对氢键少，不稳定，DNA容易解旋，因此就容易和引物结合，成为转录的起点或复制的起点。
转录起始元件：启动子（Promoter），转录起始序列，按宿主细胞类型可分为原核启动子和真核启动子；按启动基因表达的特征，可分组成型、诱导性和组织/细胞异型；基安生物启动子信息整理如下：

组织	启动子	长度	备注
神经	NSE		神经元细胞特异启动子
	mDlx		抑制性的中间神经元启动子
	ChAT		胆碱能神经元的特异启动子
	hSyn	471 bp	神经元特异性启动子hSyn。
	mecp2		短的神经元特异性启动子。
	c-fos		兴奋神经元特异性启动子。
	CaMKIIa	1.2 kb	兴奋性谷氨酸能神经元启动子
	hVGAT		GABA能神经元/中间神经元特异性启动子
	gfaABC1D		星形胶质细胞特异启动子
	lba1		小胶质细胞特异启动子
	NSE		神经原特异启动子
	GFAP104		星形胶质细胞特异启动子
	AlDH1L1		丘脑中星形胶质细胞特异启动子
	MBP		髓鞘碱性蛋白启动子，表达在少突胶质细胞
	Somatostat	1.2 kb	GABA能神经元特异性启动子
	CNP		少突胶质细胞或施万细胞特异性表达启动子
心脏	cTNT	702 bp	心脏特异性启动子
	aMHC	400 bp	小鼠肌球蛋白重链启动子
	SM22a	441 bp	平滑肌细胞特异性启动子
	MCK		肌酸激酶启动子
	Nkx2.5		心肌细胞早期特异启动子
肌肉	MCK	1.3 kb	小鼠肌肉细胞特异性启动子
	MHCK7		肌肉细胞特异性启动子
	MyOG		成肌细胞特异性启动子
内皮	TIE1		内皮细胞特异启动子
血管内皮	EnSm22a		血管平滑肌特异启动子
血管内皮	ICAM2	140 bp	血管内皮特异启动子
单核巨噬细胞	CD68		单核巨噬细胞特异启动子
巨噬细胞	F4/80		巨噬细胞特异启动子
肝脏	TBG	460 bp	肝脏特异启动子
	ALB	2.4 kb	肝脏特异启动子
	ApoEHCR-hAAT		肝脏特异启动子
胰腺	ins2		胰腺β细胞特异启动子
胰腺	PDX1		胰腺β细胞特异启动子
骨骼肌	COL2A1		软骨细胞特异启动子
骨骼肌	mRUNX2		成骨细胞早期特异启动子
眼睛	Rpe65	700 bp	视网膜色素上皮细胞特异启动子
眼睛	hVMD2	642 bp	视网膜色素上皮细胞特异启动子
肾脏	NPHS1		肾脏特异启动子
肺	SPB		肺上皮细胞特异启动子
肺	SPC		肺上皮细胞特异启动子
角质层	K14		角化细胞特异启动子
脂肪	KAPB4		脂肪细胞特异启动子
广谱启	CAG		强启动子，常用于体内表达
	EFES		EF1A的短版本
	EF1a	1.2 kb	效果弱于CMV，但体内实验效果好
	CMV	600 bp	最常用的强启动子
	CBA		类似于CAG，是人工启动子
	PGK		效果弱于CMV，体内效果好
诱导型	TRE		四环素抗性诱导启动子

转录结束元件：poly (A)信号，包含多聚腺苷酸化信号序列（-AAUAAA-）、剪切/加尾位点和下游富含G/U保守序列。转录复核物识别多聚腺苷酸化信号序列，在其下游13-20 bp处断裂RNA，并在断裂处3’端添加poly A序列（翻译增强），继续向下游移动的转录复合体，在下游富含U或GU保守序列的作用下解离。

翻译起始元件：原核生物翻译，为多顺反子模式，翻译起始的元件包含核糖体结合位点（RBS）、SD (Shine-Dalg-arno)序列序列和起始密码子（AUG），RBS位于起始密码子AUG上游的一段非翻译区；SD序列位于RBS中，长度一般为5个核苷酸，富含 G和A，与核糖体16S rRNA的3'端互补配对，促使核糖体结合到mRNA上，有利于翻译的起始。RBS的结合强度取决于SD序列的结构及其与起始密码AUG之间的距离，相距一般以4-10个核苷酸为佳，9个核苷酸最佳。真核生物中翻译的起始主要依赖mRNA的5’端帽子结构和3’端的poly A结构，为单顺反子。翻译终止密码子：UAG,UAA,UGA。
表达调控元件：WPRE是一段顺式作用的RNA元件，为转录后调控序列，放在多聚腺苷酸化信号之前可显著增加mRNA的表达水平和翻译效率，进而增强基因的表达。KOZAK序列是位于真核生物mRNA 5'端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是GCCACCAUGG，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5'帽子结构的mRNA翻译起始，对应于原核生物的SD序列。增强子位于结构基因附近，能够增强该基因转录活性的一段DNA顺序称为增强子（enhancer）。终止子位于基因编码区下游，能够终止RNA转录合成的特殊DNA序列称为终止子（terminator）。沉默子位于结构基因附近，能抑制该基因转录表达的DNA序列称为沉默子（silencer）。沉默子是一种负性调控元件。其作用特征与增强子类似，在组织细胞特异性或发育阶段特异性的基因转录调控中起重要作用。绝缘子在基因组内建立独立的转录活性结构域的边界DNA序列称为绝缘子/隔离子（insulator）。绝缘子能够阻止邻近的增强子或沉默子对其界定的基因的启动子发挥调控作用。绝缘子的抑制作用具有“极性”的特点，即只抑制处于绝缘子所在边界另一侧的增强子或沉默子，而对处于同一染色质结构域内的增强子或沉默子没有作用。
共表达元件：Linker 序列，前后共表达蛋白通过一段Linker氨基酸序列，以融合蛋白形式表达）；2A序列，前后共表达蛋白大部分在2A倒数第一和第二个氨基酸残基间断裂为两蛋白，小部分依然通过一段2A氨基酸序列以融合蛋白形式表达；IRES序列，多顺反子形式表达，RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译，后面蛋白表达量比前面低。
抗性筛选基因：一般一个质粒里会有两个抗性筛选基因，一个是质粒构建过程中细菌筛选基因（如AmpR、CamR、KanR和TetR等），另个是转染后的细胞筛选基因（如PuroR和NeoR）。

慢病毒质粒骨架：
顺/反式元件：包括LTR、Ψ、RRE和cPPT。Ψ：HIV-1病毒RNA包装成病毒所需的包装信号。RRE：HIV-1 Rev响应元件。在病毒包装过程中，Rev蛋白识别该序列介导病毒RNA出细胞核。cPPT：在目标细胞感染期间增加了病毒基因组的入核。
LTR：包含5' LTR和3' LTR，序列基本相同（U3-R-U5），分位于基因组的两端，并指向同一个方向，可介导其及其中间DNA序列整合至基因组中。因LTR同时具有启动子和多聚腺苷化功能，在野生型病毒中，5' LTR作为启动子驱动病毒基因组转录，而3' LTR作为多聚腺苷化信号终止上游转录。转录起于5' LTR的R序列第一个核苷酸起，结束于3' LTR的R序列最后一个核苷酸，并其后面多聚腺苷化；逆转录过程中，会恢复5' LTR和3' LTR完整序并最终整合至基因组中。Δ5' LTR（第三代），Δ5' LTR被删除了一个区域，该区域是LTR启动子活性所需的，通常由病毒转录因子Tat促进。这并不影响包装过程中病毒RNA的产生，因为启动子功能由Δ5' LTR上游设计的RSV启动子或CMV补充。ΔU3/3' LTR（第三代），HIV-1 3'长末端重复序列的截断版本，删除了U3区域。这导致在病毒质粒整合到宿主基因组时，5' LTR启动子活性的自我失活。ΔU3/3' LTR中包含的聚腺苷化信号用于终止转录本。
病毒结构蛋白：gag 基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol 基因，编码病毒特异性的酶；rev 基因，编码调节 gag 和 pol 基因表达的调节因子；tat基因，5'LTR是一个弱启动子，需要Tat元件的来激活它。vsvg 基因，使用水泡性口炎病毒糖蛋白基因vsvg 基因替代env基因，vsvg 基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白，拓宽了病毒的感染宿主细胞范围。
腺相关病毒质粒元件：
ITR：两端的反向重复序列包含复制和包装所需的唯一顺式作用元件。
核心基因：Rep 基因，编码参与病毒复制、包装和基因整合的蛋白主要负责病毒基因组的复制、转录调控、位点特异性整合等。Cap 基因，基因编码3个衣壳蛋白不同剪切体VP1、VP2和VP3，构成AAV的衣壳（VP1、VP2、VP3 的比例约为1:1:10），由启动子P40负责转录。
组装激活蛋白：E2A基因，DNA结合蛋白(DBP)，病毒复制相关；E4基因，病毒转录相关；VA基因，非编码RNA，促进蛋白翻译。
腺病毒质粒元件：
早期转录元件：E1A基因，包含四个保守结构域(CR1-4)，每一个都与特殊的细胞蛋白相互作用，对其他病毒基因(如E1B、E2、E3和E4)的转录至关重要。E1B基因，编码两种不同的肿瘤抗原。调控病毒复制和“晚期”基因L1-L5(病毒组装、释放和裂解所必需的)组成；E2A和E2B基因，编码腺病毒DNA复制、晚期基因的转录翻译和病毒包装相关蛋白。E3基因，病毒逃避免疫系统过程中发挥作用。E4基因，编码1-7个开放阅读框，主要晚期mRNAs, L1-L5编码病毒粒子结构蛋白，由一个pre-mRNA衍生而来，由一个主要晚期启动子(major late promoter, MLP)通过选择性剪接和聚腺苷酸化驱动。
晚期表达基因：包括L1、L2、L3、L4和L5，编码病毒结构蛋白。由一个pre-mRNA衍生而来，由一个主要晚期启动子(major late promoter, MLP)通过选择性剪接和聚腺苷酸化驱动。
包装元件：顺式包装元件ψ和两端的反向重复序列(ITR)组成。

质粒构建过程

引物设计：通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Gene模块获得基因序列，NCBI的blast模块设计对应的引物。引物设计注意事项：GC最好控制在40~60%；长度最好18~30 nt；内部重复及互补结构最好不大于3；Tm最好控制在55~60℃，两天引物Tm值差异最好不大于3；3’端结尾尽可能是G/C，避免为A；引物5’端可添加酶切位点或其它序列，如添加酶切位点，5’端需添加保护碱基（一般4个），注意避免酶切位点原核甲基化，影响后续酶切实验。

PCR扩增（以PrimeSTAR® Max DNA Polymerase为例）：
PCR体系（50μL）：

试剂	使用量	终浓度
PrimeSTAR Max Premix（2X）	25 μl	1X
Primer 1	10 ～ 15 pmol	0.2～0.3 μM
Primer 2	10 ～ 15 pmol	0.2～0.3 μM
Template	＜200 ng*
灭菌水	Up to 50 μl

*人基因组（DNA 5 ng～200 ng）大肠杆菌基因DNA（100 pg～200 ng）质粒 DNA （10 pg～1 ng）
PCR 反应条件：

	温度	时间	循环
预变性	98℃	30 sec	1
变性	98℃	10 sec	30~35
退火	60℃	5-15 sec
延伸	72℃	30～60 sec/kb
延伸	72℃	5 min	1
保存	4℃	~	-

琼脂糖凝胶电泳：
1%琼脂糖凝胶配置：琼脂糖 1g，1×TAE 100mL，加热溶解，60℃左右按1:10000加入核酸染料（如SYBR Gold或Gel-red），混匀后倒入凝胶铸槽中，插入梳子，除去气泡，待完全凝固后拔出梳子（室温30 min左右），置于电泳槽1×TAE电泳缓冲液中（缓冲液液面没过胶块1-2 mm）。
PCR或酶切产物按1:6加入6×Loading buffer，吹打混匀；取上述混合液点胶加样（选择合适DNA Maker）， 3~5V/cm电泳，待最前方指示条带跑到胶块的4分之三处，停止电泳，将凝胶放置在凝胶成像仪中拍照及切胶回收。
片段及骨架质粒酶切（以FastDigest enzyme为例）：

ddH₂O	16-x μL
10×缓冲液	2 μL
DNA	x μL
酶 1	1 μL
酶 2	1 μL
Total	20μL

轻轻混合，瞬离；37°C孵育15-20分钟（质粒和基因组DNA 15分钟；PCR产物20分钟)。添加4μL 6×Loading buffer终止酶催反应。如上述步骤进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。
胶回收：详细操作步骤见具体胶回收试剂盒说明书。
连接（以为例 T4 DNA 连接酶为例）：

	1×	0.5×
线性化质粒DNA	20-100 ng	50 ng
Insert DNA	1:1 to 5:1	3:1
Buffer	2 µL	1 µL
T4 DNA Ligase	1/5 Weiss U	0.2/1 µL
ddH2O	to 20 µL	to 10 µL
Total	20μL	10 μL

室温（22℃）孵育10 min 或者4℃过夜连接。
转化：取5µL的混合液于50µL感受态细胞中，轻柔混合，冰浴30min，42℃热激活90s。迅速冰浴3-5min，加入900 μL无抗性培养基，轻柔混匀，37℃恒温箱摇床，225 rpm摇晃培养1小时，每十分钟翻转一次。8000 rpm离心2 min，倒掉上清（注意使剩余100 μL左右）。超净工作台中，取50 μL剩余菌液，涂布于对应抗性LB固体培养基上；静置风干15分钟（待菌液干燥不流动），盖皿，倒置，37℃过夜培养。取5 mL目的抗性液体LB培养基于15 mL的EP管中，无菌10 uL枪头挑选单菌落克隆，枪头打入培养基中；轻拧管盖（勿拧紧），于37℃ 180 rpm过夜培养。
质粒提取：详细操作步骤见具体质粒回收试剂盒说明书（如天根质粒回收试剂盒）。获得的质粒，紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50 μg/ml双链DNA。纯化的质粒DNA OD260/OD280通常在1.7-1.9左右，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的实验中。
酶切及测序鉴定：取适量质粒，选择合适的酶进行酶切鉴定（2-3套不同的酶，每套至少切出3条可区分片段），按1:6添加6×Loading buffer终止酶催反应。如上述步骤进行琼脂糖凝胶电泳，成像鉴定。鉴定正确克隆，送测序。

基安基因功能研究质粒

表达质粒：一种可实现特定基因或DNA序列，在特定细胞内由由低到高或无到有或目的质粒工具。
基安生物拥有丰富的设计经验，根据客户不同实验目的，可以进行加标签，抗性等改造，以实现不同的实验要求。
结果展示

干扰质粒：一种通过将shRNA序列引入细胞中，以达到降低特定基因表达目的质粒工具。
安生物拥有丰富的干扰型病毒质粒和非病毒质粒的设计及构建的经验，可以根据老师的实验目的。基安生物可以提供干扰质粒产品如下：
基安生物干扰质粒产品：

产品类型	产品组分及要求
单条shRNA	单条shRNA
shRNA三保一	三条目的基因shRNA，空载对照
shRNA三保一升级版	三条目的基因shRNA，空载对照，转染试剂
shRNA四保一	四条目的基因shRNA，空载对照
基因过表达质粒	根据不同实验目的进行改造
质粒抽提	去内毒素

基因常备可选的shRNA质粒骨架列表：

plko.1-PURO	无荧光	PURO抗性
plko.1-NEO	无荧光	NEO抗性
plko.1-Hygro	无荧光	Hygro抗性
plko.1-copGFP-PURO	绿色荧光	PURO抗性
plko.1-mCherry-PURO	红色荧光	PURO抗性
tet-plko-PURO	tet诱导	PURO抗性
plko.1-CMV-copGFP-PURO	绿色荧光	PURO抗性

敲除质粒：一种通过将特定基因编辑工具（如CRISPR/Cas 9）引入细胞内，从而实现将特定基因或片段的删除，以达到使其无法表达的质粒工具。
安生物拥有丰富的基因敲除质粒设计及构建的经验，基安生物可以提供干扰质粒产品如下：
可以提供构建质粒服务类型：
1）   功能域研究，截短体质粒，突变质粒构建；
2）   构建miRNA，编码基因，lncRNA，circRNA，tsRNA过表达质粒；
3）   构建编码基因，lncRNA，circRNA；
4）   构建miRNA打靶双荧光素酶质粒、转录因子和启动子相互作用打靶质粒；
5）   根据老师不同实验目的定制化质粒；
优势：
1）   有丰富的质粒设计经验；
2）   快速高效的实验方案沟通；

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