基安生物技术（苏州）有限公司-基安生物 RNA基因、质粒构建、引物、病毒包装、转染试剂、IP实验服务、组学及生物信息学分析

产品类型	目标基因siRNA	siRNA NC阴性对照	FAM-siRNA转染对照	阳性对照siRNA	GA-RNA Transfection Kit转染试剂	DEPC水	目标基因qPCR引物
单条siRNA	6nmol	X	X	X	X	√	X
三保一套装	6nmol*3条	6nmol	3nmol	3nmol	X	√	X
四保一套装	6nmol*4条	6nmol	3nmol	3nmol	X	√	X
三保一套装pro版	6nmol*3条	6nmol	3nmol	3nmol	0.5mL	√	X
四保一套装pro版	6nmol*4条	6nmol	3nmol	3nmol	0.5mL	√	X
三保一套装max版	6nmol*3条	6nmol	3nmol	3nmol	0.5mL	√	5nmol*1对
四保一套装max版	6nmol*4条	6nmol	3nmol	3nmol	0.5mL	√	5nmol*1对

产品形式：冻干粉(由于影响结晶形态的因素很多，产品外观有些差异，甚至形态无法用肉眼可见，此为正常现象)
运输条件：常温运输
储存条件：请于-20℃ ~ -80℃条件下存放，冻干粉可以稳定保存一年。
注意事项1：siRNA在操作过程中，需注意避免（核酸酶RNAase，温度，极端PH等）可能导致的产品降解。请遵循RNA操作规范，带手套操作，ep管，移液枪和枪头等都要避免污染, 实验过程中，产品最好于冰上放置。

注意事项2：使用前请瞬时离心（在最大转速约为4,000g的低速条件下离心装有siRNA的EP管，让siRNA聚集在试管的底部）轻轻的打开管盖，用DEPC水或者RNase free water配制成20μmol/L的siRNA储存液，柔和地用移液枪吹打充分混匀siRNA储存液。分装保存于-20℃~-80℃，避免反复冻融（不超过5次）。

siRNA	3nmol	5nmol
DEPC水	150ul	250ul

20μmol/L的siRNA储存液的配置参考

1、细胞接种：
贴壁细胞：以293T细胞为例，接种~0.4×106 个细胞到含2mL完全培养基的六孔板培养孔中，使细胞转染时达到50-80%细胞密度。
悬浮细胞：以THP-1细胞为例，接种~0.5×106个细胞至含2mL完全培养基的六孔板培养孔中。
注)1:不同细胞初始接种数量依据不同的细胞大小，细胞类型和细胞生长速度，培养时间，实验目的相应调整，每个孔接种的细胞数量尽可能相同，且细胞均匀分布。
2:悬浮细胞、免疫细胞、原代细胞本身的特性普遍比较较难转染，可通过调整siRNA用量以及转染试剂的用量，不同的转染试剂及尽可能规范实验操作等来尝试提高转染效果，如无明显改善可更换为电转方式或其他方法。

2、siRNA转染
siRNA预混液制备：取无菌无酶EP管一支，加入46ul 的GA-RNA Buffer和4ul的20umol/L的siRNA储存液，吹打混匀。

siRNA-GA转染复合物制备：取7.5uL的GA-RNA Reagent加入到siRNA预混液的EP管中，移液枪充分吹打混匀20次以上，或者旋涡2-3s。
注：a)转染复合物在室温下可稳定存放8小时，请勿将siRNA-GA转染复合物置于冷冻条件。
b) RNA/GA-RNA Reagent的比例是GA-RNA Transfection转染试剂包封的关键因素，如需增减每孔siRNA用量，您可以按比例增加或减少加入细胞的siRNA-GA转染复合物的体积。

将siRNA-GA转染复合物加入到待转染的孔板的细胞培养基中，轻轻混匀。
迚行其他必要的特殊处理（可选，如加药处理等具体依据具体实验情况来确定）。

将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24~96h（培养时间与实验目的相关，qPCR一般为转染后24-48h收集细胞提取RNA检测RT-qPCR；WB一般为转染后48-96h收集细胞检测WB）。

试剂	孔板
试剂	96孔(ul)	24孔(ul)	12孔板	6孔(ul)
GA-RNA Buffer	2.3	11.5	23	46
20umol/L siRNA储存液	0.2	1	2	4
GA-RNA Reagent	0.38或0.75	1.9或3.8	3.8或7.5	7.5或15

终浓度40nmol/L siRNA不同培养皿的推荐转染用量
注)提供2种不同的GA-RNA Reagent转染浓度，具体浓度可根据不同的细胞摸索选择，对于多数细胞通常按照低剂量GA-RNA Reagent用量即可达到理想的转染效果。

3、siRNA效果检测
RNA水平检测：转染siRNA后24~48h进行RNA水平检测。通过qPCR检测目的基因RNA水平的变化情况是RNAi实验结果的公认标准。由于细胞种类的不同，各实验最佳检测时间也不相同。检测时间过晚可能导致检测干扰效率不佳甚至检测不到干扰效果。（注：检测的qPCR引物设计质量很重要，我司（基安生物）可提供优质的qPCR引物设计合成）
蛋白水平检测：对于编码蛋白的基因，如需进行蛋白水平检测，推荐转染后48-96h进行相应检测。由于蛋白表达受到影响因素较多，如检测蛋白水平变化不明显请检测其mRNA水平变化情况，以确定siRNA是否起作用。（注：wb检测的抗体质量很重要，我司（基安生物）可提供优质的wb抗体）

在细胞本身转染效率能够达到80%及以上转染效率，且目标基因本底的表达丰度和内参GAPDH/β-actin的Ct值在15个Ct以内的情况下, siRNA可达到70%以上的沉默效果。若经qRT-PCR鉴定，套餐中3/4条siRNA均未达到70%或以上的沉默效果，基安将根据您提供的实验结果进行分析。如核实为siRNA本身效果不佳，可免费重新设计并合成针对靶基因的2条新的siRNA。特殊物种（除人，大鼠，小鼠以外）的基因，lncRNA/circRNA不享受此售后条款。

siRNA末端可以用多种荧光标记物进行标记。标记后的siRNA可用流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等观察到，确定转染效率，优化转染条件;标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。
产品描述
我们可对siRNA末端用多种荧光标记物进行标记，反义链5'端标记会影响其基因沉默活性，所以不推荐在这一位点进行标记，在其他三个末端修饰对沉默活性几乎没有影响。我们推荐在正义链的5'端修饰，目前公认这是最佳的化学标记位点。

常见的荧光染料类型	激发波长	发射波长	颜色
FAM标记	495 nm	520 nm	Green/yellow
Cy3标记	550 nm	570 nm	Darkpink/Red
Cy5标记	650 nm	670 nm	Far red

表常见的几种荧光标记的siRNA/miRNA产品

常见问题

1. 转染率如何计算？
通过同视野明场图和荧光图进行merge或者对比，来确定被标记上荧光的细胞占整个视野细胞的百分比，从而确定细胞的转染效率大概为百分之多少。
某些细胞对荧光染料的粘附比较严重，且Cy3、Cy5为脂溶性染料，可能会造成假阳性结果，所以通过激光共聚焦显微镜成像的方式检测会更好一些，并依靠经验判断真假阳性信号。所以对于细胞的转染效率检测一般建议用FAM标记的RNA来进行检测。

2. 目的siRNA/miRNA标记荧光，同时检测转染效率和作用效果可以吗？
为尽量避免对目的 siRNA/miRNA作用效率的影响，通常建议选择用荧光标记的siRNA NC，miRNAmimic/inhibitor NC来检测转染效率。也可以对目的siRNA/miRNA mimic/inhibitor标记荧光，同时检测转染效率和作用效果，但可能会有标记后siRNA/miRNA mimic/inhibitor失效的风险。

3. 荧光标记的NC的转染效率检测能否代表目的siRNA/miRNA的转染效率？是否每次实验都必须设置荧光对照组？
转染效率的高低主要由细胞自身及所选择的转染试剂和转染方法等相关，同等实验条件下，siRNA的转染效率是相近的，荧光标记的NC转染效率可以近似认为等同于目的siRNA/miRNA。在具体的实验中，荧光对照不一定需要每次实验都做。但如果每次实验都做一个荧光对照组/阳性对照组，将会更加便于排除一些实验问题。

GA化学修饰siRNA作用机制基于目前研究结果表明是通过Dicer解链siRNA双链结构，反义互补RNA单链再利用AGO2和其他蛋白形成沉默复合体（RISC）对目标RNA进行降解。GA化学修饰siRNA是特殊化学修饰的一段长21个核苷酸的双链RNA，即用型。对合成的siRNA进行一系列化学修饰以提高siRNA的稳定性、降低脱靶效应。适合动物体内干扰实验，并且在体内实验中具有更高的稳定性和抑制效果，可采用全身注射或局部注射等多种方式给药，操作简便。

关键难题	标准的siRNA	GA化学修饰siRNA
siRNA 降解	标准的非修饰的siRNA在细胞培养过程中很容易降解，虽然在大部分的离体实验中是有效的，但是在细胞培养中寿命较短。	GA化学修饰siRNA不仅增强了在血清和细胞培养中的寿命，而且加强了在离体条件下的应用能力。
作用时效	作用时间较短，一般情况下为1-3天。	GA化学修饰siRNA作用时间长，比标准的siRNA的作用时间延长一倍左右。
活体应用的活性	标准的siRNA稳定性较差，一般不适用于体内试验。	GA化学修饰siRNA在体内的稳定性强。

in vivo RNAi常用修饰
在临床研究上，不同公司开发不同的修饰方案，比如Alnylam公司的核酸药物修饰方案就经过了STC—ESC—advanced ESC的演变，用于改善 siRNA 的成药性。同样在动物实验siRNA中重要的也是修饰方案，常用的RNAi常用修饰功能如下：
1、链间修饰如2’Ome、2’F、PS等可以有效提高抗核酸酶活性的能力，提高siRNA的稳定性；
2、LNA、2’-MOE 等能够有效的改善 siRNA 的免疫源性，降低 siRNA 的脱靶毒性，同时增加 siRNA 的有效性；
3、Chol修饰可以提高动物实验转染效率。
基因安生物提供的in vivo RNA是经过不同修饰组合，综合提高siRNA/ASO的干扰效果。

编号	修饰方式	修饰标记位置			修饰作用
编号	修饰方式	5’	middle	3’	修饰作用
1	2’-OMe	√	√	√	增强抗核酸酶活性的能力，提高RNA稳定性
2	2’-F	√	√	√
3	Phosphorothioate	—	√	—
4	2’-MOE	√	√	√	提高稳定性以及与靶向效力，降低细胞毒性
5	LNA	—	√	—	具有高亲和力,能够提高与靶标分子的稳定性,增加熔解温度(Tm值);
6	Cholesterol	√	—	√	提高转染效率以及RNA稳定性
7	GALNAC	—	—	√	具有肝脏靶向性和长效抑制作用
8	FAM	√	—	—	具有荧光，优化各种细胞的转染条件，跟踪RNA在细胞或者动物的位置分布
9	Cy3	√	—	√
10	Cy5	√	—	√
11	Amino	√	—	√	用于连接一些不会影响其功能的化合物，可以抑制外切酶酶解
12	Thiol	√	—	√	用于加附各种修饰如荧光标记物和生物素。
13	Biotin	√	—	√	生物素修饰具有结合链霉亲和素的特性，可用于非放射性免疫分析。
14	Phosphorylation	√	—	—	磷酸化可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应

常用修饰方式以及作用
动物体内RNAi药物(siRNA﹑miRNA agomir，miRNA antagomir﹑ASO等)的一般给药方法与途径，
几种常见的给药方式及选择参考

常见给药方式	适应模型	备注说明
局部给药	大脑、肌肉、皮肤、骨关节、眼睛、鼻腔、耳蜗、皮下瘤、膀胱、子宫腔，鞘内, 皮肤（表皮、真皮和皮下组织）等。	局部给药一般通过注射﹑滴入﹑涂抹或喷雾等方式直接导入到一个特定的组织或器官中。最直接，效果佳，用量小，能快速被吸收。
系统给药	循环系统（免疫系统）、作用于血流丰富的脏器（肝脏、心脏、肺脏、肾脏、脾脏，肿瘤组织）、腹腔等。	系统给药一般采用静脉注射，一些无法通过具体直接给要的脏器和靶点。
靶向性给药	利用载体（纳米材料，LNP，GalNAc等）将核酸药物选择性靶向病灶或者特定给药部位。	低免疫原性，低细胞毒性，高靶向性

不同产品不同给药方式单次给药剂量参考

动物用核酸产品	通用给药剂量（单次）
动物用核酸产品	小鼠局部给药	大鼠局部给药	小鼠系统给药	大鼠系统给药
GA化学修饰siRNA	1~10nmol	2~15nmol	5~20nmol	20~100nmol
GA化学修饰ASO	1~10nmol	2~15nmol	5~20nmol	20~100nmol
agomir	1~10nmol	2~15nmol	5~20nmol	20~100nmol
antagomir	5~20nmol	10-50nmol	50~200nmol	200~1000nmol

注：
1：局部给药的推荐给药剂量为单次单个给药部位的给药剂量。

2：靶向性给药的剂量需要结合材料本身的特性（材料的包封量，包封效率，靶向性或一些其他特性等特性），以及结合是局部注射还是尾静脉注射来具体确定合适的单次给药量和给药频频。

不同给药部位及给药方式的给药体积参考

给药体积	小鼠	大鼠
颅内（海马体）注射	1~4 uL	2-5 uL
眼部（玻璃体）注射	1~2 uL	1~3 uL
尾静脉注射	50~150 uL	100~200 uL
腹腔注射	100~200 uL	200~300 uL
皮下瘤注射	10~50 uL	10~100 uL

动物用核酸产品给药操作指导示例（局部+系统给药）
1：系统给药通用操作指导（以肝脏部位原位瘤模型为例）
系统给药：适应模型：循环系统（免疫系统，血液循环系统）、作用于血流丰富的脏器（肝脏、心脏、肺脏、肾脏、脾脏）此类疾病模型，建议尾静脉给药。

1）注射体积和计量（以miRNA agomir尾静脉注射小鼠为例）
通过尾静脉注射，小鼠建议每次注射体积50-150μl左右；对于初次操作的人员，可用Balb/c小鼠练习尾静脉注射操作，注射灭菌后的PBS或者注射用生理盐水。
小鼠/裸鼠（20g体重）miRNA agomir/化学修饰siRNA/ASO推荐剂量：每次每只小鼠/裸鼠注射5~20nmol；miRNA antagomir推荐剂量：每次注射50~200nmol。

2）注射剂的配制
以10 nmol agomir冻干粉一管为例，瞬时离心后直接加入50ul-150ul葡萄糖注射液或注射用生理盐水/灭菌的1xPBS进行稀释。
例如实验组为6只小鼠，对照组6只小鼠为例，具体依据客户自身的实验情况来确定分组和每组的动物数量，以用量为10nmol agomir / agmir NC/只小鼠为例。
注射时，以10 nmol agomir /agmir NC冻干粉一管为例，先瞬时离心, 然后开盖每管agomir / agmir NC直接加入50ul~150ul注射用葡萄糖注射液/注射用生理盐水/灭菌的1xPBS，枪头轻缓吹打，充分混匀稀释溶解agomir / agmir NC。
然后将溶解后的50ul-150ul的agomir /agmir NC的葡萄糖/注射用生理盐水溶液/灭菌的1xPBS进行尾静脉注射，刚好一支agomir / agmir NC注射一只小鼠/裸鼠。
推荐每隔3-4天给药一次。如果需要时间拉长到一周给药一次，最好按照单次建议的给药剂量范围的大剂量进行给药为佳，条件允许的情况下更推荐每隔3/4天给药一次为佳，或每2周做一次连续3天注射。
注：miRNA agomir /antagomir /化学修饰siRNA/ ASO由于涉及多种化学修饰，避免反复冻融。尽量按照单次/单次单只动物的给药剂量来进行分装。

3）注射时间
针对急性模型（作用时间小于一周），建议单次大剂量注射；
针对慢性模型（作用时间超过一周），建议中低剂量多次给药，每隔3-4天注射一次加强效果。如果给药需要持续的时间4周以上，可以考虑大剂量每周给药一次，或者每2周做一次连续3天注射。
注：以上数据来源于大量科研工作者的实验结果，由于miRNA/mRNA/lncRNA/circRNA本身丰度差异大，作用的部位不一，目前动物实验的agomir/antagomir/化学修饰siRNA/化学修饰ASO注射剂量无法建立统一标准，科研人员可根据我们的推荐剂量结合预实验的初步结果进行调整。

2：局部给药通用操作指导（以皮下瘤模型为例）
局部给药：适应模型：大脑、肌肉、皮肤、骨关节、眼睛、鼻腔、耳蜗、皮下瘤、膀胱、子宫腔，鞘内, 皮肤（表皮、真皮和皮下组织）等局部此类疾病模型。

1）注射体积和剂量（以miRNA agomir尾静脉注射小鼠为例）
注射体积10µl~50µl，常用注射体积为50µl；前期如果肿瘤体积较小，为了减少注射后出现反流，可选择减少注射体积。对于初次操作的人员，可以事先在建好的皮下瘤模型上注射灭菌PBS或者注射用生理盐水，作为注射操作的预实验。miRNA agomir（过表达）/化学修饰siRNA/ASO推荐给药剂量：每次注射1~10nmol。miRNA antagomir(沉默) 推荐给药剂量，每次注射5~20nmol，建议可以剂量大一些。
2）注射剂的配制：
以5 nmol agomir冻干粉一管为例，瞬时离心后直接加入10ul-50ul葡萄糖注射液或注射用生理盐水/灭菌的1xPBS进行稀释。
例如实验组为6只小鼠，对照组6只小鼠为例，具体依据客户自身的实验情况来确定分组和每组的动物数量，以用量为5nmol agomir / agmir NC/只小鼠为例。
注射时，以5 nmol agomir /agmir NC冻干粉一管为例，先瞬时离心, 然后开盖每管agomir / agmir NC直接加入10ul~50ul注射用葡萄糖注射液/注射用生理盐水/灭菌的1xPBS（依据不同时期肿瘤大小来进行灵活调整溶解体积），枪头轻缓吹打，充分混匀稀释溶解agomir / agmir NC。
然后将溶解后的10~50ul的miRNA agomir的灭菌1xPBS/生理盐水溶液/葡萄糖注射液在瘤体内进行多点注射，可注射3~4处（前期瘤体小，可以只单点或者2点注射），一次性用完。
推荐每隔3-4天给药一次。如果需要时间拉长到一周给药一次，最好按照单次建议的给药剂量范围的大剂量进行给药为佳，条件允许的情况下更推荐每隔3/4天给药一次为佳，或每2周做一次连续3天注射。
注：miRNA agomir /antagomir /化学修饰siRNA/ ASO由于涉及多种化学修饰，避免反复冻融。尽量按照单次/单次单只动物的给药剂量来进行分装。
3）注射时间：
小鼠/裸鼠种植肿瘤细胞后，大约长至5mm X 5mm大小时即可以开始注射miRNA agomir/antagomir/化学修饰siRNA/化学修饰ASO（一般皮下瘤建模时间需要1-2周左右，具体将根据肿瘤细胞的生长速度而定），每只小鼠/裸鼠每3~4天左右注射一次，肿瘤模型注射周期通常多为2-4周（具体依据不同肿瘤类型，肿瘤生长速度，实验具体情况进行相应调整）。注射后每天测量并计算瘤体体积，绘制生长曲线。之后取肿瘤组织，进行切片染色、qPCR、WB等实验检测抑制效果，检测相关关注的指标。（其他疾病模型需要依据模型，实验方案等来确定具体的给药周期）

针对急性模型（作用时间小于一周），建议单次大剂量注射；
针对慢性模型（作用时间超过一周），建议中低剂量多次给药，每隔3-4天注射一次加强效果。如果给药需要持续的时间4周以上，可以考虑大剂量每周给药一次，或者每2周做一次连续3天注射。
注：以上数据来源于大量科研工作者的实验结果，由于miRNA/mRNA/lncRNA/circRNA本身丰度差异大，作用的部位不一，目前动物实验的agomir/antagomir/化学修饰siRNA/化学修饰ASO注射剂量无法建立统一标准，科研人员可根据我们的推荐剂量结合预实验的初步结果进行调整。

ASO简介
GA化学修饰ASO 是小核酸药物之一的反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides）英文缩写，基于目前研究结果表明，ASO降解RNA是通过单链ASO直接结合RNA在RNaseH作用下降解RNA。 GA化学修饰ASO是特殊化学修饰的一段长20bp的单链DNA-RNA Chimeras，即用型。对合成的ASO进行一系列化学修饰以提高ASO的稳定性，降低细胞毒性。适合动物体内干扰实验，并且在体内实验中具有更高的稳定性和抑制效果，可采用全身注射或局部注射等多种方式给药，操作简便。
ASO作用机制
1 基于目前研究结果表明，ASO和siRNA作用降解mRNA的机制也略有不同，如图所示ASO降解mRNA是通过单链ASO直接结合mRNA在RNaseH作用下降解mRNA，而siRNA如左图所示，通过Dicer解链siRNA双链结构，反义互补RAN单链再利用AGO2和其他蛋白形成沉默复合体（RISC）对目标RNA进行降解。

Molecules. 2015 Oct; 20(10): 17944–17975.
Fig ASO与siRNA沉默mRNA机制
2 ASO除了沉默mRNA外还有其他作用机制，例如：可以与miRNA结合抑制miRNA的作用，与mRNA UTR区结合抑制mRNA蛋白翻译，结合到外显子和内含子区域实现外显子剪切跳跃，还可以结合到启动子区域实现启动子区域甲基化或乙酰化等作用改变基因表达水平。如下图：

Nature reviews Drug discovery, 16(3),2017
Fig3 ASO作用调控基因机制

ASO细胞内作用时效
1 ASO在细胞水平发挥作用时效有研究表明，ASO接触细胞后1个小时即可通过细胞胞吞作用进入细胞，其中一部分可以在20min左右就可以结合到核内或核外RNA，通过40min可以招募到RNaseH1，进行RNA降解。也就是2个小时左右ASO就可以进行实现RNA水平干扰。当然考虑细胞转染过程及蛋白水平及功能表现，通常在24～48小时进行检测（实验目的另有要求需另行考虑）。

DOI: 10.1089/nat.2016.0656
Fig ASO进入细胞及发挥作用时效模式图

2 另外，有研究表明ASO针对不同区域的RNA干扰效果也有所差异，有认为ASO更容易入核，适合核内RNA干扰，如下图7所示，针对主要位于核内的MALAT1，ASO有着较好的抑制效果。因此，对于核内定位基因可以尝试ASO进行调控。而对于核外基因siRNA干扰效果看似更为有效。当然，不同基因、不同细胞、不同时间及调控方式等差异也会可能导致调控效果出现不一样的结果。

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